間充質(zhì)干細胞外泌體（MSC EXOs）近年來已經(jīng)在傷口愈合、神經(jīng)損傷、肝病以及新冠肺炎等領域被廣泛研究應用。不少研究表明，在各種損傷和疾病模型中，MSC EXOs 可以作為間充質(zhì)干細胞的替代選擇。

第四軍醫(yī)大學去年就在干細胞領域權威期刊 Stem Cell Research & Therapy 發(fā)表文章[1]，發(fā)現(xiàn) MSC EXOs 逆轉(zhuǎn)肝纖維化，是間充質(zhì)干細胞（MSCs）治療肝臟疾病的重要機制。MSC EXOs 正逐漸成為再生醫(yī)療領域的「新武器」，也為臨床疾病研究提供新思路。

如何通過高純度外泌體？加快研究速度

外泌體相關研究越來越熱，賽道也愈發(fā)精細，如何巧用外泌體，并讓它服務于自己的課題呢？不論是 MSC EXOs 還是其他外泌體，高純度提取一直是實驗的前提。

本文分享 3 個影響外泌體結果準確性的因素，并給到大家詳細的培養(yǎng)操作步驟參考，并總結操作過程中的 4 個常見 QA 帶你提升外泌體純度。

01 3 個因素影響外泌體結果準確性

1. 血清：常規(guī)細胞培養(yǎng)使用胎牛血清 FBS + 基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，但是胎牛血清中富含外泌體，后續(xù)培養(yǎng)后收集的細胞上清中的外泌體不確定是從細胞分泌的還是血清中來的，影響結果的準確性。

2. 營養(yǎng)：細胞培養(yǎng)是需要一定的營養(yǎng)的，那么如果不加血清，單獨只用基礎培養(yǎng)基，就會導致細胞處于饑餓狀態(tài)，嚴重影響細胞生長，甚至出現(xiàn)吞噬外泌體的現(xiàn)象，影響實驗結果。

3. 雜蛋白：去外泌體胎牛血清可以很好地解決 1、2 中涉及的問題，但還會存在雜蛋白影響蛋白定量結果，導致數(shù)據(jù)偏高，影響后續(xù)實驗的準確性。如果使用外泌體專用無血清培養(yǎng)基（專門針對外泌體獲取的培養(yǎng)基，化學成分明確，類似于完全培養(yǎng)基的一種介于血清和無血清之間的營養(yǎng)狀態(tài)），滿足腫瘤細胞和T細胞等細胞增殖的同時，可以降低雜蛋白等的影響，獲取更高純度的外泌體。

要提取外泌體，前期的細胞培養(yǎng)是研究的根基，樣本準備是影響整個后續(xù)實驗的關鍵所在。以下是「細胞上清外泌體提取操作指南」，助你提升外泌體提取純度，優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)。

02 外泌體提取操作指南

1. 細胞復蘇及傳代：細胞復蘇后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 2～3 代至細胞生產(chǎn)狀態(tài)正常；

2. 階段培養(yǎng)一：待細胞匯合度約為 50% 時，移去原有完全培養(yǎng)基，添加新培養(yǎng)基（50% 外泌體專用無血清培養(yǎng)基 + 50% 完全培養(yǎng)基）；

3. 階段培養(yǎng)二：待細胞在梯度培養(yǎng)一中生長匯合度約為 70～80% 時，移去原有的 50% 外泌體專用無血清培養(yǎng)基 + 50% 完全培養(yǎng)基；

4. 使用 1X PBS 溶液將細胞潤洗 2～3 次；

5. 加入外泌體專用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24～48 h，待細胞匯合度到 90%～100% 時收取細胞培養(yǎng)上清液，該上清液即可用于外泌體提取實驗。

*注：若使用 DMEM、1640 等常規(guī)培養(yǎng)基，會導致培養(yǎng)的細胞上清中外泌體含量很少，因為細胞在饑餓狀態(tài)下會將囊泡作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收（如圖 1-B ）。這樣的換培養(yǎng)基操作主要目的是為了保證細胞要有密度差，確定細胞在正常生長，融合度的數(shù)值不是固定的。此培養(yǎng)基無法替代常規(guī)培養(yǎng)基，只可用于 48 h 以內(nèi)短時間培養(yǎng)理論上細胞狀態(tài)好可以循環(huán)多次實驗。

A：無外泌體血清組

B：正常血清組

C：外泌體專用無血清培養(yǎng)基組

圖 1 三種不同的培養(yǎng)體系的外泌體 TEM 電鏡圖（Hela 細胞）

通過 TEM 電鏡結果圖可以簡單評估外泌體純度，背景越干凈，外泌體呈現(xiàn)越清晰，說明本身提取的外泌體純度越高。圖 1 中使用三種不同的培養(yǎng)體系培養(yǎng)細胞后提取外泌體，其中專用無血清培養(yǎng)基組還是背景較干凈，說明該組外泌體純度最高。

03 4 個外泌體提取常見問題及解析

看來外泌體專用無血清培養(yǎng)基在實驗過程中，起到關鍵作用，但在實際操作時依舊可能會發(fā)生「意外問題」，如：換液時間拿不定、專用無血清培養(yǎng)基使用時機不好把握等等，以下 4 個常見問題與解決方案帶你「防患于未然」，更好地運用外泌體無血清培養(yǎng)基，讓實驗更順利。

Q：用濃縮后的外泌體感染細胞，是否可以使用正常的培養(yǎng)基？感染后需要多久進行換液？

A：在外泌體和細胞共孵育實驗過程中，建議使用無血清培養(yǎng)基來完成，4～6 小時進行換液。若使用高營養(yǎng)的血清培養(yǎng)基，可能存在其他物種外泌體的干擾，因為在高營養(yǎng)情況下，細胞對于目的外泌體的吸收能力可能會下降。

Q：外泌體專用無血清培養(yǎng)基使用時機，是在細胞誘導成模前，還是加藥后？是否可以用本培養(yǎng)基配藥？

A：1. 正式實驗前先預實驗檢測實驗細胞是否能在外泌體專用培養(yǎng)基中正常生長增殖。

2. 如果預實驗結果沒有問題，正式實驗中，可以用外泌體專用培養(yǎng)基配藥進行培養(yǎng)收集，可能問題是收集的培養(yǎng)上清中含藥物，不清楚藥物信息，不確定藥物是否會影響外泌體提取的效果。

3. 外泌體專用培養(yǎng)基不適用于傳代細胞培養(yǎng)，無促細胞貼壁因子。

4. 如果實驗細胞不適應外泌體專用培養(yǎng)（營養(yǎng)成分不足，增殖不顯著），則可選擇去外泌體血清配置的培養(yǎng)基培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清提取外泌體。

Q：外泌體專用培養(yǎng)基是否可用于重懸、接種以及繼續(xù)培養(yǎng)細胞

A：不可以。不能在傳代后就換此基礎培養(yǎng)基（例如 DMEM、1640 等基礎培養(yǎng)基），該培養(yǎng)基中沒有促使細胞貼壁的因子。外泌體專用培養(yǎng)基可以維持細胞一定時間的生長，但無法替代完全培養(yǎng)基，也很難達到完全培養(yǎng)基的效果。

A：現(xiàn)已有用戶將該培養(yǎng)基用于除腫瘤細胞和 T 細胞外的其他細胞并發(fā)表文章。保險起見，建議您在正式實驗前先預實驗檢測實驗細胞是否能在外泌體專用培養(yǎng)基中正常生長增殖。因為外泌體專用培養(yǎng)基不適用于傳代細胞培養(yǎng)，無促細胞貼壁因子，如果實驗細胞不適應外泌體專用培養(yǎng)（營養(yǎng)成分不足，增殖不顯著），則可選擇去外泌體血清配置的培養(yǎng)基培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清提取外泌體。

想要數(shù)據(jù)準確，一定要選擇有文獻應用、驗證可靠的培養(yǎng)基。上文實驗方法和 QA，均基于使用下方兩個好物的外泌體提取實驗，多篇文獻引用驗證[2,3]，質(zhì)量可靠，為你的實驗保駕護航～

直擊文中好物

1 外泌體專用無血清培養(yǎng)基

Umibio® 外泌體專用培養(yǎng)基含有 HEPES，L-Glutamine, Pharm Grade Albumin, Hypoxanthine, Thymidine, Phenol Red, Glucose（偏低糖 2 g/L）. 無動物源 Xeno-free, Serum-free，不含生長因子（Growth factors），細胞培養(yǎng)過程中無需添加血清即可達到完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)狀態(tài)。該培養(yǎng)基更方便，不需要再配置，降低污染概率，有利于外泌體的收獲。更適合腫瘤細胞和 T 細胞，不適合傳代培養(yǎng)。

2 去外泌體胎牛血清

Umibio® 去外泌體胎牛血清由無菌采集的健康胎牛血清過濾而成，去除 ≥ 99% 的胎牛血清內(nèi)源外泌體，并與處理前的胎牛血清具相同的細胞生長速率和形態(tài)。去外泌體血清則營養(yǎng)更充足，細胞活性更好；適用細胞體外增殖培養(yǎng)，收獲目標細胞的外泌體。

文獻引用：

[1]. Tian, S., Zhou, X., Zhang, M. et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes protect against liver fibrosis via delivering miR-148a to target KLF6/STAT3 pathway in macrophages. Stem Cell Res Ther 13, 330 (2022). 

[2]. Song, T.; Zhou, M.; Li, W.; Zheng, L.; Wu, J.; Zhao, M. Tripeptide Leu-Ser-Trp Regulates the Vascular Endothelial Cells Phenotype Switching by Mediating the Vascular Smooth Muscle Cells-Derived Small Extracellular Vesicles Packaging of miR-145. Molecules 2022, 27, 7025. 

[3]. Yanglin Zhu, Hong Qin, Chenglu Sun, Bo Shao, Guangming Li, Yafei Qin, Dejun Kong, Shaohua Ren, Hongda Wang, Zhaobo Wang, Jingyi Zhang, Hao Wang, "Endometrial Regenerative Cell-Derived Exosomes Attenuate Experimental Colitis through Downregulation of Intestine Ferroptosis", Stem Cells International, vol. 2022, Article ID 3014123, 15 pages, 2022.