*本文中YuanStem 20，簡寫成YS20。

1. 準(zhǔn)備工作

A. 配置YS 20完全培養(yǎng)基

1.1 將YS20 10x Supplement提前一天取出置于2℃-8℃條件下解凍。

1.2 用無菌移液管將50ml 10x Supplement與450ml YS20 Basal Medium混合均勻，成為YS20完全培養(yǎng)基（以下簡稱YS20完全培養(yǎng)基）。

* YS20完全培養(yǎng)基可在2℃-8℃避光條件下保存1月，使用前預(yù)熱至室溫。

B. 使用Matrigel或VTN包被孔板

1.3a Matrigel包被孔板：按照使用品牌的說明書操作進(jìn)行孔板包被，以0.1ml/cm2的用量(1ml/六孔板1孔)將Matrigel稀釋液加入TC處理的培養(yǎng)容器中，晃動容器使其覆蓋全部表面，37℃培養(yǎng)箱中包被一小時以上。

*包被好的孔板可以封口后在2-8℃保存，2周內(nèi)使用。

1.3b VTN包被孔板：按照使用品牌的說明書操作進(jìn)行孔板包被，推薦使用10ug/ml濃度進(jìn)行包被，培養(yǎng)箱（37℃）靜置至少2小時后使用。

2. 使用YS20培養(yǎng)基復(fù)蘇細(xì)胞

2.1 YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基配制：室溫預(yù)熱YS20完全培養(yǎng)基，根據(jù)所用凋亡抑制劑（如Y27632等）推薦濃度加入適當(dāng)體積的凋亡抑制劑，配置YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基。

*Y27632推薦濃度為5-10uM。

2.2 吸棄包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中平衡pH和溫度。

2.3 將細(xì)胞從液氮罐中取出，置于干冰上，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房內(nèi)。手持凍存管置于37℃水浴鍋或細(xì)胞復(fù)蘇儀中解凍，凍存管內(nèi)*剩小片冰晶時，用70%酒精表面消毒。

2.4 將凍存管內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有9ml DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，輕輕吹打，200 g 離心 3 分鐘，吸棄上清，用1-2ml YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基重懸。

*使用DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基潤洗凍存管內(nèi)側(cè)以盡可能多地收集細(xì)胞。

2.5 以合適的密度將重懸后的細(xì)胞接種至步驟2.2準(zhǔn)備的六孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中以十字法搖晃均勻，24h后更換為YS20完全培養(yǎng)基。

*復(fù)蘇時通常以50萬細(xì)胞/孔或更高密度接種,正常情況下6小時內(nèi)絕大部分細(xì)胞都可以完成貼壁。

3. 以單細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行傳代和凍存

*當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時，可以進(jìn)行傳代。

3.1 室溫預(yù)熱YS20完全培養(yǎng)基、PBS（不含鈣、鎂，下同）、TrypLE Express消化液和Matrigel/VTN包被的六孔板，并配置YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基（步驟2.1）。

3.2 吸棄包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中平衡pH和溫度。

3.3 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，吸棄培液。每孔加入1ml PBS，輕柔晃動孔板以潤洗表面一次，吸棄。每孔加入1ml TrypLE Express，置于37℃培養(yǎng)箱中消化3-5分鐘。

*觀察到細(xì)胞有明顯脫壁跡象（細(xì)胞團(tuán)邊緣明顯變亮，但其主體部分仍未脫壁）時即可進(jìn)行下一步操作。

3.4 每孔加入1ml YS20完全培養(yǎng)基，用移液器輕柔吹打3-4次，將所有細(xì)胞懸液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，200 g 離心 3 分鐘，吸棄上清，用1-2ml YS20復(fù)蘇/傳代培養(yǎng)基重懸后計數(shù)。

3.5 以合適的密度將重懸后的細(xì)胞接種至步驟3.2準(zhǔn)備的六孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中以十字法搖晃均勻，24h后更換為YS20完全培養(yǎng)基。

*傳代擴(kuò)增每個孔接種密度為10-30萬細(xì)胞，其他分化實驗根據(jù)需求密度接種；接種后剩余的細(xì)胞如果需要保留，可以離心去上清后以2×106/ml的密度凍存。

4. 以細(xì)胞團(tuán)形態(tài)進(jìn)行傳代和凍存

*將PSC消化成細(xì)胞團(tuán)形態(tài)進(jìn)行傳代和凍存對細(xì)胞造成的壓力較小，適合不需要精確控制細(xì)胞接種數(shù)量的場景，如日常留種傳代。

4.1 室溫預(yù)熱YS20完全培養(yǎng)基、PBS、0.5mM EDTA和Matrigel/VTN包被的六孔板。

4.2 吸棄包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20完全培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中平衡pH和溫度。

4.3 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，吸棄培液。每孔加入1ml PBS，輕柔晃動孔板以潤洗表面一次，吸棄。每孔加入1ml 0.5mM EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化5-8分鐘。

*顯微鏡下觀察，細(xì)胞團(tuán)邊緣明顯變亮、有脫壁跡象時即可終止消化。

4.4 用移液器輕柔吹打3-4次使細(xì)胞團(tuán)從六孔板表面脫落，并形成較為均勻的細(xì)胞懸液，將所有細(xì)胞懸液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，200 g 離心 3 分鐘，吸棄上清，用1-2ml YS20完全培養(yǎng)基重懸。

*如果細(xì)胞的貼壁力度較強(qiáng)，也可使用細(xì)胞刮刀輔助傳代。

4.5 根據(jù)后續(xù)實驗計劃，在步驟4.2準(zhǔn)備的六孔板中以1:5-1:20的比例接種細(xì)胞團(tuán)，在37℃培養(yǎng)箱中以十字法搖晃均勻，24h后更換新的YS20完全培養(yǎng)基。

*接種后剩余的細(xì)胞如需保留，可以離心去上清后以估算的100萬/管的密度凍存。

5. YS20多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的傳代/換液方案

YuanStem 20多能干細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品如下——

上海倍篤生物科技有限公司，致力于為細(xì)胞&基因zhiliao、抗體藥、mNGS病原檢測&RNase抑制、干細(xì)胞及外泌體等領(lǐng)域，提供高質(zhì)量、合規(guī)試劑原料。目前，倍篤生物是ArcticZymes Technologies、MBL、Tonbo、Leinco、Nordmark、SEQURNA、邁銳生物、再帆生物等品牌的中國區(qū)代理。