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所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，之后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核...

膜片鉗的應(yīng)用：對藥物作用機(jī)制的研究：在通道電流記錄中，可分別于不同時間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，研究它們對通道功能的可能影響，了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動物生理功能的分子機(jī)理。這是膜片鉗技術(shù)應(yīng)用較普遍的領(lǐng)域，既有對西藥藥物機(jī)制的探...

膜片鉗系統(tǒng)有如下應(yīng)用局限性(1)光能應(yīng)用于懸浮細(xì)胞的紀(jì)錄，因此大部分的紀(jì)錄對象為化細(xì)胞，而對于需要貼壁生長的大多數(shù)正常細(xì)胞，現(xiàn)有的自動膜片鉗系統(tǒng)就無法紀(jì)錄；(2)在紀(jì)錄對象上，目前的膜片鉗系統(tǒng)只能紀(jì)錄胞膜形狀平整飽滿的細(xì)胞，大部分是工具細(xì)胞如化細(xì)胞，此類細(xì)胞有...

全自動膜片鉗系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)：1）操作簡單，全過程可自動化。2）實驗迅速，通量高。一般每天可達(dá)到50個實驗數(shù)據(jù)左右。3）藥液交換迅速。細(xì)胞內(nèi)、外液的交換是在平面芯片上進(jìn)行，所以藥液交換非常迅速，作用時間快，外灌流時間常數(shù)：~200ms內(nèi)灌流時間常數(shù)：~2s。4）藥...

電壓鉗與膜片鉗有什么區(qū)別？電壓鉗技術(shù)是通過向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流，從而將細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映離子流的大小和方向。膜片鉗技術(shù)鉗制的是膜片，是指采用尖銳端經(jīng)過處理...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括Real-time PCR在內(nèi)的多項應(yīng)用技術(shù)。自誕生后Real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡單的增擴(kuò)到整個PCR過程，Real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特...

膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用范圍：①膜片鉗技術(shù)在通道中的研究；②與藥物作用有關(guān)的心肌離子通道研究；③對離子通道生理與病理作用機(jī)制的研究；④對單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究；⑤對藥物作用機(jī)制的研究；⑥在心血管藥理方面的研究；⑦創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選的研究；⑧在神經(jīng)科學(xué)中的研究...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗污染：PCR反應(yīng)的很大特點是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因：標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)...

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照；內(nèi)參的設(shè)定主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin...

Real-time PCR雙熒光標(biāo)記探針設(shè)計原則：具體的其他要求可以具體聯(lián)系設(shè)計公司，拿到合成好的引物，需要先確認(rèn)引物的性能?？梢杂眠@對引物先擴(kuò)增梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品介紹見后續(xù)內(nèi)容）。由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品的加量和其對應(yīng)的Ct值，描繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這里要注意...

Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技...

膜片鉗的數(shù)據(jù)如何處理：穿孔膜片(perforated patch)是為克服常規(guī)全細(xì)胞模式的胞質(zhì)滲漏問題,有學(xué)者將與離子親和的制霉菌素或二性霉素b經(jīng)微電極灌流到含有類甾醇的細(xì)胞膜上,形成只允許一價離子通過的孔,用此法在膜片上做很多導(dǎo)電性孔道,借此對全細(xì)胞膜電流進(jìn)...

Real-time PCR實驗注意事項-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機(jī)玻璃的電泳槽等，可...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù)，可在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡單，廉價和可靠的方法復(fù)制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學(xué)...

膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。是研究離子通道的較重要的技術(shù)。目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventionalpatchclamptechnique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術(shù)（Automatedpatchclamptechnique）。傳統(tǒng)膜...

Real-time PCR鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)

膜片鉗使用的注意事項：1.為了防止塵埃、靜電傷害機(jī)器，每天做實驗前請用清水拖地。2.拉制儀使用前需預(yù)熱15-30min。3.銀絲電極及地線發(fā)白時，請先用砂紙輕微打磨，再浸入新鮮的次氯酸鈉溶液鍍氯化銀，如果銀絲電極30min未變黑，則考慮更換次氯酸鈉。4.先開放...

膜片鉗技術(shù)的工作原理：膜片鉗技術(shù)是用于了解離了通道行為的通用型電生理工具，首先用微玻管電極(膜片電極或膜片吸管)接觸細(xì)胞膜，然后以千兆歐姆以上的阻抗使電極尖銳端與細(xì)胞膜封接，通過吸破或者電破的方式使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域與其周圍區(qū)域在電學(xué)上分隔，然...

膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù)：膜片鉗技術(shù)的建立，對生物學(xué)科學(xué)特別是神經(jīng)科學(xué)是一資有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的（或多個的離子通道分子活動的技術(shù)。些技術(shù)的出現(xiàn)自然將細(xì)胞水平和分子水平的生理學(xué)研究聯(lián)系在一起，同時又將神經(jīng)科學(xué)的不同...

膜片鉗操作實驗：標(biāo)本制備根據(jù)研究目的的不同，可采用不同的細(xì)胞組織，如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞等，現(xiàn)在幾乎可對各種細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗的研究。對所采用的細(xì)胞，必須滿足實驗要求，一般多采用酶解分離法，也可采用細(xì)胞培養(yǎng)法；另外，由于與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，現(xiàn)在也運用分子...

膜片鉗技術(shù)的工作原理：膜片鉗技術(shù)是用于了解離了通道行為的通用型電生理工具，首先用微玻管電極(膜片電極或膜片吸管)接觸細(xì)胞膜，然后以千兆歐姆以上的阻抗使電極尖銳端與細(xì)胞膜封接，通過吸破或者電破的方式使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域與其周圍區(qū)域在電學(xué)上分隔，然...

Real-time PCR：使用Real-time PCR進(jìn)行基因檢測,被普遍應(yīng)用于病毒和病原菌檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、遺傳病基因檢測等領(lǐng)域。一般首先需要利用專業(yè)使用的試劑盒從待檢樣品中提取其核酸（DNAorRNA），并經(jīng)過精制等復(fù)雜的操作（通常稱為前處理操作）...

膜片鉗使用操作流程及注意事項：1.實驗結(jié)束后必須關(guān)閉實驗室的水電，檢查實驗室門窗。2.凡是使用儀器的同學(xué)必須履行實驗室相關(guān)要求，完成值日等相關(guān)工作（值日生按照實驗室統(tǒng)一所發(fā)值日生要求履職）。3.在儀器使用以前及使用之后按按照使用時長做好登記工作。4.拉制儀提前...

膜片鉗技術(shù)基本原理與特點：膜片鉗技術(shù)本質(zhì)上也屬于電壓鉗范疇，兩者的區(qū)別關(guān)鍵在于：①膜電位固定的方法不同；②電位固定的細(xì)胞膜面積不同，進(jìn)而所研究的離子通道數(shù)目不同。電壓鉗技術(shù)主要是通過保持細(xì)胞跨膜電位不變，并迅速控制其數(shù)值，以觀察在不同膜電位條件下膜電流情況。因...

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，之后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核...

Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位...

Real-time PCR式反應(yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整...

膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù)實驗流程之電機(jī)制備和實驗的記錄和分析數(shù)據(jù)：電極制備：膜片微電極是將玻璃毛細(xì)管用電極拉制儀拉制而成的，主要分為以下步驟：拉制：膜片微電極是將玻璃毛細(xì)管用拉管儀拉制而成。涂硅酮樹酯：將硅酮樹酯涂于微電極的較尖銳端以外的部分，然后將其通過加熱鎳鉻...

膜片鉗技術(shù)—打開細(xì)胞電生理研究之門：膜片鉗技術(shù)（patchclamptechniques）是采用鉗制電壓或電流的方法對生物膜上離子通道的電活動進(jìn)行記錄的微電極技術(shù)。膜片鉗技術(shù)的原理：用一個尖銳端直徑在1.5-3.0um的玻璃微電極接觸細(xì)胞膜表面，通過負(fù)壓吸引使...

膜片鉗在通道研究中的重要作用：用膜片鉗技術(shù)可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時可發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型，并能在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上進(jìn)一步計算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開放概率，還可以用以研究某些胞內(nèi)或胞外物質(zhì)對離...